比利時Braeckmans教授：納米氣泡光孔法高效轉染mRNA
發布時間：2021-10-09 09:32:45 人氣：1369
通過轉染核酸進行高效、安全的細胞工程仍然是基礎生物醫學研究和許多新的治療應用(如基于cart細胞的治療)的長期障礙之一。近年來，mRNA作為一種比基于病毒或DNA轉座子的方法更安全、更通用的替代工具越來越受到關注。然而，現有非病毒性mRNA傳遞途徑的局限性阻礙了這些難以轉染免疫細胞的基因工程的進展。
Intracellular Delivery of mRNA in Adherent and Suspension Cells by Vapor Nanobubble Photoporation
Laurens Raes, Stephan Stremersch, Juan C. Fraire, Toon Brans, Glenn Goetgeluk, Stijn De Munter, Lien Van Hoecke, Rein Verbeke, Jelter Van Hoeck, Ranhua Xiong, Xavier Saelens, Bart Vandekerckhove, Stefaan De Smedt, Koen Raemdonck, Kevin Braeckmans
Nano‑Micro Lett.(2020)12:185
本文亮點
1. 蒸氣納米氣泡VNB光穿孔是一種很有前途的轉染貼壁細胞和懸浮細胞mRNA的物理技術。
2. 與VNB光穿孔過程相關的參數被優化以實現高效的mRNA轉染。
3. VNB光穿孔產生的活體轉染Jurkat T細胞是電穿孔的五倍，即目前用于T細胞的標準非病毒轉染技術與電穿孔相比。
內容簡介
比利時根特大學Kevin Braeckmans教授等在本研究中，證明金納米粒子介導的蒸氣納米氣泡(VNB)光穿孔是一種有前途的物理轉染方法，能夠在粘附細胞和懸浮細胞中遞送mRNA。在HeLa細胞上進行的初步轉染實驗表明轉染緩沖液和載體濃度的重要性，而該技術進一步證明可在Jurkat T細胞中有效遞送mRNA，轉染效率高達45％。重要的是，與電穿孔相比，電穿孔是T細胞非病毒轉染的參考技術，轉染的活Jurkat T細胞數量增加了五倍。總而言之研究結果表明，將VNB光穿孔技術作為一種更溫和有效的技術用于粘附細胞和懸浮細胞的細胞內mRNA傳遞，具有在治療和基礎研究應用中未來改造細胞的潛力。
圖文導讀
VNB光孔法轉染mRNA
研究了用60 nm陽離子PDDAC包被的AuNPs作為光熱納米粒進行VNB光穿孔的適用性。直徑為60 nm的AuNPs被認為是理想的光熱敏化劑，需要最小的氣泡成核閾值激光注量。對于VNB光孔法轉染，首先用陽離子AuNPs孵育細胞。在沖洗掉未結合的AuNPs后，用單個激光脈沖7 ns照射會導致細胞結合的AuNPs產生VNBs。當熱能被消耗時，VNBs不可避免地崩塌，導致細胞膜上的局部孔隙形成，使細胞外mRNA分子通過這些膜孔直接擴散到細胞質中。
圖1. 氣相納米泡(VNB)光孔法轉染mRNA的優化方法。(a) VNB光孔法轉染mRNA的示意圖。(b) 用天然瓊脂糖凝膠電泳分析物理mRNA的完整性；1 μg eGFP mRNA 孵育HeLa細胞上特定的時間，事先用/不用Opti-MEM洗滌。作為對照，mRNA只在Opti-MEM Opti-MEM-ctrl中培養或用10 μg mL RNAse A RNAse A ctrl孵育30分鐘。
II VNB光孔法在貼壁細胞中轉染mRNA
HeLa細胞系在這里作為初始優化的參考細胞類型，因為它已經被廣泛用于通過VNB光孔作用來量化細胞內各種分子(siRNA和納米抗體)的傳遞。優化了VNB光孔法的相關參數，包括AuNP濃度、激光能量、轉染緩沖液和mRNA濃度，以達到最大的轉染效率和可接受的細胞毒性。與絕大多數對粘附細胞系的科學研究相一致，HeLa細胞實驗選擇了80%的細胞毒性閾值。
實驗結果表明，細胞活力保持在80%以上的情況下，選擇8×10⁷ AuNPs mL ~5 AuNPs/細胞為最佳濃度，可產生約16%的eGFP陽性細胞；在3.6 J cm的激光照射下，可產生高達20%的eGFP陽性細胞；DPBS+作為HeLa細胞的轉染緩沖液時，轉染效果最好；隨著mRNA濃度的增加，eGFP陽性細胞的百分比增加，1.5 μM mRNA的eGFP陽性細胞比例達到38%。
圖2. 金納米粒子AuNP濃度和激光照射量優化eGFP-mRNA轉染HeLa細胞。(a) 在0.3 μM-eGFP-mRNA存在下，使用1.8 J cm的固定激光能量，不同濃度的AuNP來光孔化HeLa細胞。(b) 在0.3 μM eGFP-mRNA存在下，使用8×107 AuNP mL的固定AuNP濃度，不同強度的激光能量來光孔化HeLa細胞。轉染效率用流式細胞術(n≥3)測定的eGFP陽性細胞百分比表示。細胞活力值用CellTiter-Glo測定，并與未處理對照組(n=3)的相對值表示。采用單因素方差分析和Dunnett多重比較試驗確定統計學差異(ns:無顯著差異；p<.05; p<.01; p<.001)。
圖3. HeLa細胞mRNA轉染緩沖液的篩選。用不同的轉染緩沖液：Opti-MEM(OM)、DPBS-、DPBS+或DMEM/F-12，通過VNB光孔法(0.3 μM mRNA；8×107 AuNPs mL；3.6 J cm)轉染HeLa細胞。(a) 轉染后24小時HeLa細胞的典型共焦顯微鏡圖像(比例尺=150 μm)。(b) 用流式細胞術(n=6)測定不同緩沖液與OM的轉染效率比。進行單因素方差分析和Dunnett多重比較試驗，以確定OM和其他緩沖液之間的統計差異(ns=無顯著性；****p<.0001)。(c) 轉染后24小時的細胞活力，與未經處理的對照組相比(n=3)。進行單因素方差分析和Dunnett多重比較試驗，以確定OM和其他緩沖液之間的統計差異(ns=無顯著性；p<.05；p<.001)。
圖4. 提高eGFP-mRNA濃度對轉染效率的影響。(a) 不同濃度eGFP-mRNA的轉染效率，以eGFP陽性細胞百分比表示(n=3)。(b) eGFP-mRNA轉染HeLa細胞典型實驗的等高線圖。
III eGFP‑mRNA轉染Jurkat T細胞通過VNB光孔法
用Jurkat E6-1人白血病T細胞系作為原代人T細胞模型。與HeLa細胞轉染實驗相似，首先對Jurkat細胞VNB光孔化過程中的不同關鍵參數進行了優化(圖5)，即：(1)AuNP濃度；(2)激光注量；(3)轉染緩沖液。實驗結果表明，4×10⁷AuNPs mL (~2 AuNPs/細胞)的濃度為最佳條件，在該條件下約13%的初始細胞群是可存活和轉染的；在0.9 J cm的最低激光能量下，活細胞和轉染細胞的產量最高(~14%)；用OptiMEM作為轉染緩沖液，在Jurkat細胞上轉染效率最好。
圖5. 金納米粒子(AuNP)濃度、激光能量和轉染緩沖液對eGFP-mRNA轉染Jurkat細胞的優化。轉染效率表示eGFP陽性細胞的百分比，細胞活力值是相對于未經處理的對照組計算的，產量是轉染效率和細胞活力的乘積。(a, b) 使用1.8 J cm的固定激光注量篩選AuNP濃度(n=3，用Dunnett的多重比較試驗進行單向方差分析，ns=無顯著性；p<.05，***p<.001)。(c, d) 使用4×10⁷AuNP mL⁻1的固定AuNP濃度篩選激光能量(單位：J cm)(n=3，采用Dunnett多重比較試驗的單向方差分析，ns=無意義；p<.05，p<.01)。e, f 比較Opti-MEM(OM)和DPBS+作為轉染緩沖液的轉染效率，使用4×10 AuNPs mL的固定AuNP濃度和0.9 J cm的激光能量(n=3，未配對的Student T檢驗，ns=不顯著)
圖6. 連續多次VNB光孔處理對Jurkat細胞mRNA轉染效率的影響。(a) 轉染效率代表eGFP陽性細胞的百分比，細胞活力值是相對于未經處理的對照組計算的。(b) 計算不同條件下的活細胞/轉染細胞、活細胞/未轉染細胞和死亡細胞的數量n≥3，單因素方差分析與Tukey的多重比較試驗，p<0.05，ns=無顯著性。
IV VNB光穿孔比核型感染產生更多活的mRNA轉染Jurkat細胞
電穿孔是目前最常用的非病毒核酸轉染和T細胞體外修飾技術，將我們的技術與商業的電穿孔系統進行比較，結果顯示轉染的活Jurkat T細胞數量增加了五倍。
圖7. 核型感染和VNB光孔法mRNA轉染Jurkat細胞的比較。(a) 根據制造商的說明，通過核感染將eGFPmRNA (0.3 μM)轉染Jurkat細胞。轉染后24 h(n=3)用CellTiter-Glo法測定轉染效率(即eGFP陽性細胞百分比)和細胞活力。(b) 核型感染和VNB光孔法在活細胞、轉染細胞產量方面的比較(n≥3，未配對Student T檢驗；****p<0.0001)。(c, d) 轉染后5天，在不同時間點測定VNB光孔(c) 或核感染(d) 后的細胞活力。第0天，在轉染后2h測定細胞活力。每天計算與未處理對照組相比的細胞活力值(n=2×3)。(e, f) 在轉染后5天，在不同時間點測量VNB光孔(e) 或核感染(f) 后的正常細胞生長。在第0天計算與未處理對照組相比的標準化細胞生長值。數據表示為平均值±SEM(n=2×3，未配對Students t test T；ns=無顯著性，p<0.001，p<0.0001。
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